Como en toda la Iglesia, la acumulación de beneficios y la ausencia de los Obispos de sus sedes, junto a otras lacras del régimen feudal, ocasionaron una decadencia y desorientación de la vida religiosa que tuvo como consecuencia la dolorosa reacción de la Reforma protestante y la vigorosa respuesta católica que se inició en el Concilio de Trento.

Pero en nuestra diócesis ya había comenzado antes la verdadera reforma con la llegada del arzobispo Santo Tomás de Villanueva (+ 1555), religioso agustino, modelo de austeridad y caridad, el cual, ayudado por religiosos y sacerdotes valencianos como el Venerable Agnesio, inició la reforma del clero y del pueblo, entre otras cosas con la fundación del Colegio de la Presentación de Nuestra Señora, antecedente de los seminarios tridentinos, que todavía existe en Valencia. Esta obra reformadora alcanzó su cumbre con el largo pontificado de San Juan de Ribera (+ 1611), durante el cual tuvo lugar la expulsión de los moriscos y la repoblación cristiana de muchos territorios.

Este santo arzobispo quiso dejar un testimonio de la fe y la piedad católica hacia la Eucaristía propugnada en Trento y expresada en la liturgia entonces, fundando el Real Colegio Seminario de Corpus Christi, que permanece en Valencia como centro espiritual y formativo de sacerdotes, siendo a la vez uno de sus más bellos monumentos, donde se conservan las costumbres dispuestas por el santo Fundador en sus Constituciones.

La Iglesia ha reconocido la santidad de varios religiosos de esta época, como los beatos Nicolás Factor (+1583), Andrés Hibernón (+1602), Gaspar de Bono (+1604), Josefa María de Santa Inés (+1696) y los santos Luís Bertrán (+1581), evangelizador y patrono de Colombia y Pascual Bailón (+1592), patrono de las asociaciones eucarísticas.

Por último, entre muchos valencianos que ofrecieron sus vidas por el Evangelio en el extremo Oriente, están el beato Francisco Gálvez (+1632) y San Jacinto María Castañeda (+1773).